Elastografía de coherencia óptica de vibraciones ambientales desviadas para perfilar propiedades mecánicas de células, organoides y tejidos

May 23, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 543 (2023) Citar este artículo

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Se ha demostrado que el papel del entorno mecánico en la definición de la función, el desarrollo y el crecimiento de los tejidos es fundamental. La evaluación de los cambios en la rigidez de las matrices tisulares a múltiples escalas se ha basado principalmente en equipos invasivos y, a menudo, especializados, como AFM o dispositivos de prueba mecánicos que no se adaptan bien al flujo de trabajo del cultivo celular. En este documento, hemos desarrollado un método de elastografía de coherencia óptica pasiva imparcial. , aprovechando las vibraciones ambientales en la muestra que permite la elaboración de perfiles cuantitativos no invasivos en tiempo real de células y tejidos. Demostramos un método robusto que desacopla la dispersión óptica y las propiedades mecánicas compensando activamente el sesgo de ruido asociado a la dispersión y reduciendo la varianza. La eficiencia del método para recuperar la verdad del terreno se valida in silico e in vitro, y se ejemplifica para aplicaciones clave como el perfilado mecánico del curso del tiempo de esferoides de hueso y cartílago, modelos de cáncer de ingeniería de tejidos, modelos de reparación de tejidos y células individuales. Nuestro método es fácilmente implementable con cualquier sistema de tomografía de coherencia óptica comercial sin modificaciones de hardware y, por lo tanto, ofrece un gran avance en la evaluación mecánica de tejidos en línea de las propiedades mecánicas espaciales para organoides, tejidos blandos e ingeniería de tejidos.

Se ha demostrado que el entorno mecánico en la homeostasis tisular es fundamental para la función, el desarrollo y la patología de múltiples órganos1,2,3. La rigidez de la matriz puede ser un indicador informativo en muchas aplicaciones biológicas y médicas. En la ingeniería de tejidos, las propiedades mecánicas a granel y espaciales de los injertos diseñados son cruciales para su éxito clínico después de la implantación4,5,6,7. Por ejemplo, la limitación de nutrientes puede crear una región central más blanda en el cartílago diseñado8,9. En la investigación del cáncer, la rigidez diferencia el tejido maligno del tejido sano10, y monitorear el cambio en la rigidez del modelo de células cancerosas 3D en respuesta al tratamiento con medicamentos contra el cáncer puede indicar potencialmente la efectividad del medicamento11. En el ojo, la rigidez de la córnea es indicativa de su desempeño óptico bajo presión intraocular12. Los enfoques tradicionales para probar las propiedades mecánicas de los tejidos modificados generalmente requieren contacto directo con el tejido y no son estériles, lo que implica la terminación del cultivo celular13,14. Además, solo proporciona valores a granel en lugar de información localizada sobre la heterogeneidad mecánica espacial del tejido diseñado. Los cultivos de fabricación o a largo plazo necesitan un control continuo fácil sin dañar los cultivos 3D y los sistemas ópticos proporcionan una solución potencial. Por lo tanto, se necesita un sistema para el control estéril en línea de las propiedades mecánicas espaciales y de volumen de los tejidos 3D in vitro, como las matrices de semillas celulares, los organoides o los explantes ex vivo.

La cuantificación y el mapeo espacial de la rigidez, un proceso conocido como elastografía, generalmente se puede realizar estimulando un espécimen, midiendo su deformación e infiriendo sus propiedades mecánicas mediante el ajuste a un modelo parametrizado. La elastografía se implementó primero con imágenes de ultrasonido15, luego con MRI16 y más recientemente con métodos ópticos como se revisó recientemente17. La tomografía de coherencia óptica (OCT)18 es particularmente adecuada para el seguimiento de la deformación de la elastografía en muestras pequeñas, debido a su capacidad de generación de imágenes en 3D no invasiva de alta resolución19 y su capacidad para codificar con precisión el desplazamiento a través de su fase20.

Los primeros métodos de elastografía de coherencia óptica (OCE, por sus siglas en inglés) usaban la compresión superficial con seguimiento de manchas21,22 y la medición posterior del desfase23, ​​pero el concepto se ha realizado con muchas otras formas de estimulación con y sin contacto24. Un enfoque exitoso es lanzar ondas de corte controladas en el material desde una carga dinámica puntual a través de un soplo de aire25 y medir la velocidad de la onda resuelta espacialmente usando OCT, que está estrechamente relacionada con la rigidez del material26 y se ha demostrado in vivo27. Las ondas de corte difusas de banda ancha que se producen de forma natural también se pueden aprovechar para medir la longitud de onda de corte28,29, un concepto utilizado por Nguyen et al.30 con OCT, donde se denomina "elastografía pasiva". Un enfoque estrechamente relacionado de Zvietcovich et al.31 mide la longitud de onda de corte de las ondas reverberantes de una matriz de fuentes de puntos de contacto que vibran a una sola frecuencia, donde se aplicó con éxito ex vitro para cuantificar la rigidez de la córnea.

La elastografía pasiva es una técnica convincente para el contraste mecánico, ya que se puede realizar con sistemas OCT sin modificaciones de hardware adicionales. Sin necesidad de contacto con los materiales, el análisis se puede realizar de forma estéril para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aunque la adquisición es asíncrona y lenta en relación con la fuente vibratoria, lo que permite el uso de sensores de marco bajo, aún se puede estimar la longitud de onda de corte a partir de una serie de campos de desplazamiento utilizando el algoritmo de ajuste de Bessel de correlación cruzada de la ref. 31 o relación entre desplazamiento y energía de deformación de la ref. 30. Sin embargo, mientras que el primero tiene una resolución espacial limitada en todo el plano de ajuste, el segundo está intrínsecamente sesgado por los niveles variables de ruido. Por lo tanto, proponemos un análisis denominado OCE de vibraciones ambientales desesgadas para formar una estimación desesgada espacialmente variable de la longitud de onda local, que es adecuada para materiales de diferentes tamaños y propiedades de dispersión óptica.

Primero simulamos una onda de corte que viaja en un material bifásico según la ecuación. (4) (Fig. 1a) con una longitud de onda de λ1 = 2 mm en la región azul y λ2 = 4 mm en la región amarilla, y probó el rendimiento de nuestro algoritmo para recuperar la verdad del terreno con una adquisición lenta y asíncrona en comparación a la fuente vibratoria. Las mediciones de fase de lapso de tiempo (N = 195) correspondientes al campo de desplazamiento inducido por la onda de corte que viaja en el material (plano x-y) se simulan en la Fig. 1b con un ruido gaussiano blanco aditivo (varianza σ = 0.05), y utilizados como entradas para los algoritmos OCE que estiman la longitud de onda a lo largo del eje x (Fig. 1c). El algoritmo OCE pasivo como se presenta en la ref. 30 está sesgado por el ruido en las mediciones, que mostramos teóricamente. Este efecto se demuestra en la Fig. 1c y se investiga más a fondo con diferentes variaciones del nivel de ruido en la Fig. 1d. Como el ruido en las estimaciones de desplazamiento de OCT está relacionado con su relación señal/ruido32,33, este contraste de elastografía pasiva está directamente relacionado con las propiedades de dispersión del material. Por lo tanto, los materiales con rigidez idéntica pero diferente dispersión óptica se diferenciarán incorrectamente con este algoritmo. Para aliviar este problema, presentamos un enfoque que compensa activamente este sesgo de ruido y reduce la varianza a través del filtrado espacial. La efectividad de esto se demuestra en los mapas de longitud de onda en la Fig. 1a y los perfiles de línea en la Fig. 1c. La estimación desesgada corrige el error promedio, pero introduce una gran cantidad de varianza, atribuida a la compensación entre sesgo y varianza. Finalmente, nuestro algoritmo OCE de vibración ambiental sin sesgo propuesto produce una estimación de baja varianza sin sesgo muy cercana a la verdad del terreno. Lo que es más importante, las tendencias son consistentes para niveles de ruido variables en la Fig. 1d, lo que permite desacoplar la intensidad de dispersión y el contraste mecánico.

a Muestra la verdad del terreno con ondas que viajan lateralmente en un material bifásico a longitud de onda λ1 = 2 mm y λ2 = 4 mm, la estimación sesgada de la elastografía pasiva según la ecuación. (6)29, la estimación desesgada de varianza alta de la ecuación. (8) y la estimación filtrada sin sesgo propuesta de la ecuación. (9), que forma el contraste mecánico. Las longitudes de onda están codificadas por colores en la figura según la barra de colores. b Muestra la medición de fase de lapso de tiempo simulada inducida por el campo de desplazamiento calculado a partir de la realidad del terreno con la adición de un fondo ruidoso. c Muestra los perfiles de línea a través de las regiones coloreadas en a. El panel d es el sesgo de longitud de onda estimado para la elastografía pasiva (todas las líneas rojas) y la OCE de vibración ambiental sin sesgo (líneas azules) a niveles de ruido crecientes.

La medición fiable de la longitud de onda elástica permite entonces producir una estimación de la rigidez. Para materiales isotrópicos linealmente elásticos, por ejemplo, E ∝ λ2, donde E es el módulo de Young y λ es la longitud de onda estimada a través de nuestro algoritmo. A través de la calibración y las mediciones en las mismas condiciones, se puede encontrar la constante de proporcionalidad. A continuación se resumen más detalles sobre la relación entre la longitud de onda y los módulos elásticos.

Luego, validamos nuestro enfoque con geles de agarosa acelular de rigidez variable, que se resume en la Fig. 2, con detalles de implementación y procesamiento y protocolo experimental completamente descrito en 'Métodos'. Después de las imágenes de OCT, el módulo de Young de estos geles se midió usando una prueba de compresión estándar. Las imágenes de intensidad de OCT y los mapas de contraste mecánico calculados de estos hidrogeles se muestran en la Fig. 2a. Todos los geles tenían la misma cantidad de agente de contraste óptico pero una concentración diferente de agarosa, que se correlacionó con su rigidez34, para desacoplar la dispersión óptica y las propiedades mecánicas. Hay un aumento visible en la estimación de la rigidez con el aumento de la concentración de los mapas λ. Comparado con el módulo de Young de grupos de cada concentración de gel (n = 3), como se muestra en la Fig. 2c, existe una fuerte correlación lineal (r = 0,994) que valida el modelo E ∝ λ2 para este material. De ahora en adelante nos referiremos a la longitud de onda media al cuadrado, λ2, como 'rigidez relativa'.

a Muestra ejemplos de intensidad y contraste mecánico. Todas las imágenes tienen un tamaño de 3×3 mm. El panel b es un perfil de línea de borde y una resolución espacial calculada como el FWHM de la derivada sigmoidea ajustada como en la ecuación. (13); se encontró que la resolución espacial del borde axial correspondiente era de 38,1 μm. c Calibración mecánica realizada como un ajuste lineal entre la longitud de onda al cuadrado y el módulo de Young de Bose ElectroForce (n = 3), asumiendo el modelo elástico en la ecuación. (3); Las barras de error muestran la desviación estándar. Las imágenes de intensidad de OCT se muestran como el logaritmo de la intensidad media.

La agarosa híbrida que se muestra en la Fig. 2a muestra la capacidad de medir la rigidez heterogénea y las variaciones locales, similar a la de la ref. 30. En este caso, nuestro algoritmo produce un fuerte contraste entre las dos mitades del gel y consistente con la profundidad. Finalmente, estimamos que la resolución espacial de nuestro método y sistema a partir de las transiciones de borde, con el perfil correspondiente en la Fig. 2b, es de 47,4 μm lateralmente y 38,1 μm axialmente, comparable a la informada por la ref. 31; el método para calcular la resolución espacial se detalla en la sección Métodos. Sin desviar, la elastografía pasiva también puede proporcionar un contraste mecánico similar al que se muestra en la ref. 30. Sin embargo, la medición cuantitativa de la longitud de onda de corte se subestima en gran medida (véanse las Figs. 1c y S2d), especialmente en presencia de ruido (Fig. 1d). En contraste, la OCE de vibración ambiental desviada proporciona un valor preciso para la longitud de onda en la simulación (Fig. 1c), incluso en presencia de ruido (Fig. 1d), y un valor realista para la longitud de onda para muestras reales que se correlaciona bien con las mediciones mecánicas. (ver Fig. 2c).

El análisis de la rigidez de la matriz durante la ingeniería de tejidos ortopédicos es fundamental para la evaluación y las posibles medidas de resultados para la fabricación de implantes médicos. Como una aplicación del análisis OCE de vibración ambiental sin sesgo en la ingeniería de tejido óseo, cultivamos gránulos de células madre mesenquimales (MSC) en diferenciación osteogénica durante 21 días, mientras medimos continuamente su rigidez con OCE de vibración ambiental sin sesgo de manera estéril en línea. La validación se realizó en un subconjunto de muestras con pruebas mecánicas de punto final. A partir de las pruebas mecánicas, que se muestran en la Fig. 3b, hay un marcado aumento en el módulo de Young de los tejidos óseos manipulados durante todo el cultivo. Este aumento del contraste mecánico también es claro en los mapas λ de la Fig. 3a en cada uno de los gránulos a lo largo del tiempo. Luego se cuantificó la rigidez relativa de la OCE de vibración ambiental desviada sobre cada uno de los gránulos y se muestra en la Fig. 3c, que muestra un aumento monótono sobre el cultivo para cada muestra, en línea con los datos de las pruebas mecánicas. Se observó una mayor tinción de colágeno en gránulos osteogénicos con el tiempo de cultivo, lo que indica el crecimiento en el contenido de matriz tras el cultivo, lo que respalda aún más los datos de las pruebas mecánicas y el análisis OCT. Se observaron heterogeneidades espaciales tanto en los mapas de contraste mecánico como en la histología.

El panel a son ejemplos de intensidad y contraste mecánico de tejidos óseos manipulados (por triplicado) en los días 3, 10 y 21. Todas las imágenes presentadas son de 1 × 1 mm. b Muestra el módulo de Young del tejido, probado con un equipo de compresión personalizado (n = 4)40. El panel c es la rigidez relativa para cada muestra a lo largo de la cultura (n = 3). d Histología con tinción de rojo picrosirius para el contenido de colágeno en gránulos osteogénicos en los días 3, 10 y 21. La tinción naranja indica citoplasma y la tinción roja indica nuevas fibrillas de colágeno sintetizadas; barra de escala: 100 μm. e Muestra la intensidad y el contraste mecánico de los tejidos de cartílago modificados estimulados por presión hidrostática durante 21 días. El panel f es el contenido de glicosaminoglicanos (GAG) de las muestras (n = 4), y g muestra la rigidez relativa del análisis OCE de vibración ambiental sin sesgo (n = 3). * denota una diferencia significativa con p < 0,05 y ** de p < 0,01 calculados con la prueba Anova de 1 vía seguida de una comparación de medias de Tukey-Kramer. Las barras de error representan la desviación estándar.

Luego, aplicamos el análisis OCE de vibración ambiental sin sesgo a los sedimentos de células MSC cultivados en un medio condrogénico durante 21 días. N=3 muestras se sometieron a presión hidrostática para mejorar aún más la diferenciación, mientras que el resto (N=3) se mantuvo como control. Como se esperaba, el análisis bioquímico mostró un aumento en el contenido de glicosaminoglicanos (GAG) en el grupo estimulado, como se muestra en la Fig. 3f, lo que implica un aumento en la rigidez, y esto se refleja bien tanto en los mapas λ de la Fig. 3e como en el análisis cuantitativo resumido. en la figura 3g.

Exploramos el potencial de OCE de vibración ambiental desviada en la investigación del cáncer para monitorear las propiedades mecánicas espaciales de un modelo de cáncer de ingeniería tisular. Primero cultivamos geles de colágeno sembrados con fibroblastos durante 11 días. Como era de esperar, nuestro análisis mostró un aumento constante en la rigidez relativa del gel de colágeno sembrado con fibroblastos durante el tiempo de cultivo, Fig. 4a, b. Luego, las células de cáncer de ovario se sembraron sobre el gel de colágeno durante 7 días y se pudieron distinguir fácilmente de la capa de gel de colágeno analizando el contraste mecánico entre las dos Fig. 4c, d. Esto fue apoyado por la histología (Fig. 4e, f).

a Muestra la intensidad y el contraste mecánico de los geles de colágeno sembrados con fibroblastos durante un cultivo de 11 días. Todas las imágenes presentadas son de 6×3 mm. b Muestra su rigidez correspondiente a lo largo del tiempo. c Muestra la intensidad y el contraste mecánico de los geles de colágeno con y sin células cancerosas cultivadas encima durante 7 días. d Propiedades mecánicas medidas a lo largo de la línea roja que se muestra en c. e, f Imágenes histológicas para c teñidas con hematoxilina y eosina. Barra de escala: 1 mm.

OCT es una herramienta de rutina para oftalmología y nuestro método podría extender estas capacidades al monitoreo de rutina de reconstrucciones de superficie. Por lo tanto, investigamos el potencial de OCE de vibración ambiental desviada para evaluar la calidad y la eficiencia de un sistema de gel para reparar pequeñas lesiones de la córnea. Las córneas porcinas (N = 3) se perforaron mediante biopsia para generar una herida local. Luego, se inyectó una solución de fibroína de seda metacrilada al 15% o al 20% en el sitio de la lesión, se entrecruzó con UV y se tomaron imágenes con OCT (Fig. 5a). El análisis OCE de vibración ambiental sin sesgo mostró una rigidez relativa significativamente más alta en el grupo de gel al 20%, lo cual está en línea con los datos mecánicos obtenidos mediante las pruebas de reología (Fig. 5b, c). Si bien las imágenes de intensidad de OCT no mostraron vacíos evidentes en la interfaz entre el gel y la córnea en ninguno de los grupos, se identificaron vacíos claros para ambos grupos en el mapa de contraste mecánico (λ) (ver flechas blancas), lo que indica la existencia de una solución de gel sin curar. . Esto sugiere que la vibración ambiental desviada OCE puede ser una herramienta poderosa para evaluar la calidad y la eficiencia de la reparación de tejidos.

a Muestra la intensidad y el contraste mecánico de córneas porcinas intactas y tras implantar dos concentraciones diferentes de hidrogel; las flechas blancas indican áreas de gel sin curar, que muestran un alto contraste mecánico pero no en intensidad. b Muestra el módulo de almacenamiento de la reología de muestras de hidrogel (n = 3). c Muestra la rigidez relativa de las exploraciones OCT (n = 3). d Muestra un estudio sobre las propiedades mecánicas de los ovocitos de ratón: comparación de ovocitos de tipo salvaje con zona intacta y sin zona y ovocitos intactos sin histona H3.3; los ovocitos de tipo salvaje zona intacta exhiben una mayor heterogeneidad de rigidez marcadamente diferente de la eliminación de H3.3 de zona intacta libre de zona y menos competente en el desarrollo. Las imágenes de ovocitos se han recortado a 100 × 300 micrómetros (x-z). * denota una diferencia significativa con p < 0,05 y ** de p < 0,01 calculados con la prueba Anova de 1 vía seguida de una comparación de medias de Tukey-Kramer. Las barras de error representan la desviación estándar.

Los estudios de fertilidad de rutina pueden implicar la evaluación de la viabilidad y la capacidad de desarrollo de los ovocitos prefecundados. Estudios recientes sugieren que la rigidez del ovocito está asociada con su viabilidad y potencial de desarrollo embrionario35. La aplicación del análisis OCE de vibración ambiental sin sesgo a los ovocitos de ratón se resume en la Fig. 5d. Comparamos ovocitos intactos y despojados de la zona pelúcida de ratones de tipo salvaje y Cabin1 knockout, que se ha demostrado que causa la detención del desarrollo embrionario36. En primer lugar, se observó una diferencia significativa en la longitud de onda media frente al grupo de control, lo que podría ser un medio para evaluar su viabilidad como en las refs. 35,37. El mapa de contraste mecánico mostró un anillo exterior más rígido en la zona intacta de tipo salvaje en comparación con los ratones knockout de cabina 1 sin zona y con zona intacta (Fig. 5d). Esto sugiere que la OCE de vibración ambiental desviada puede ser una herramienta eficaz para la detección sin contacto de ovocitos competentes en el desarrollo de una manera no invasiva, en contraste con la aspiración con micropipeta34.

El análisis de vibración ambiental sin sesgo es un algoritmo de posprocesamiento para derivar mapas de contraste mecánico cuantitativos a partir de exploraciones OCT, que desacopla la dispersión y las propiedades mecánicas. El enfoque se basa en la estimación de la longitud de onda de las ondas elásticas ambientales generadas por múltiples fuentes en condiciones de laboratorio. En los laboratorios de investigación óptica, generalmente se requiere realizar experimentos en un entorno libre de vibraciones. Sin embargo, una gran cantidad de fuentes de vibración cercanas y distantes, como la calefacción, la ventilación, el aire acondicionado, las incubadoras, las bombas, las computadoras, los equipos científicos y los sistemas de transporte por carretera y ferrocarril se suman a un ruido de fondo vibratorio inevitable que se acopla al entorno circundante. Con este fin, los sistemas ópticos se construyen sobre mesas de vibración pasivas o activas especializadas. Sin embargo, en nuestro estudio, intencionalmente operamos nuestro sistema OCT en un banco para beneficiarnos completamente de las vibraciones ambientales.

Además, realizamos un análisis FEM para mostrar que las vibraciones externas aplicadas a una placa de pozo generan suficientes ondas en la muestra. También vale la pena señalar que en nuestra configuración experimental, tenemos que tomar medidas para reducir la magnitud de las vibraciones ambientales colocando la placa en una cámara con una base de goma para evitar la envoltura de fase y los artefactos provocados por grandes desplazamientos.

Las vibraciones ambientales también son relevantes para los estudios in vivo, ya que se han utilizado ondas de corte que surgen naturalmente de la actividad del cuerpo humano para evaluar cualitativamente las propiedades elásticas de los tejidos28,38.

Además, también se ha demostrado el potencial de la elastografía de coherencia óptica pasiva in vivo para una córnea de rata con ojo anestesiado30.

La resolución espacial es una consideración importante para cualquier método de imagen, y la capacidad de resolver diferentes rigideces de materiales es una ventaja principal de OCE. Teóricamente, nuestro método está limitado solo por el número de píxeles sobre los que se calcula la potencia de deformación o el núcleo del filtro. Para el estudio de agarosa en la Fig. 2, calculamos la tensión lateralmente con una ventana deslizante de 7 píxeles y usamos un filtro gaussiano con una desviación espacial estándar de 5 píxeles, lo que lleva a un FWHM de 11,8 píxeles y una resolución espacial esperada de 41,3 μm lateralmente y 20,9 μm axialmente, que es comparable a los 47,4 μm y 38,1 μm que medimos empíricamente desde la transición del borde. En presencia de ruido, existe un equilibrio entre el sesgo, la resolución espacial y la varianza que puede controlarse mediante los parámetros Ng y Nh. Cuanto mayor sea el ruido, menor será la resolución espacial alcanzable para una precisión dada, por lo que el nivel de dispersión óptica es importante para una alta SNR, sin atenuar la señal y reduciendo la penetración. Finalmente, nos referimos a la longitud de onda media como la rigidez relativa, despreciando la viscoelasticidad. Esto fue motivado por el hecho de que en el tejido blando incompresible, el comportamiento elástico está dominado por el módulo de corte que varía linealmente con el cuadrado de la longitud de onda de la onda de corte como se usa comúnmente en la elastografía pasiva30. Nuestros datos experimentales (Fig. 2c), que muestran una fuerte dependencia lineal (r = 0.994) entre el módulo de Young medido y el cuadrado de la longitud de onda de la onda transversal validaron que el comportamiento viscoelástico podría despreciarse en esta aproximación. En nuestro estudio, hemos validado el enfoque utilizando ejemplos comunes en los que la rigidez es una evaluación central durante la cultura o la evaluación de resultados. Nuestros resultados han demostrado cómo podemos evaluar tejidos ortopédicos como el cartílago y el hueso durante la diferenciación en tejidos intactos, modelos de cáncer de ingeniería tisular, evaluación de la fertilidad de los ovocitos in vitro y aplicaciones oftalmológicas en las que se puede evaluar la rigidez del biomaterial con el tiempo después de la implantación.

Vibraciones ambientales desviadas OCE es una herramienta poderosa para evaluar espacialmente biomateriales y biomatrices in vitro en cultivo 3D, ya que produce una imagen de contraste mecánico cuantitativo, o mapa λ, que se desacopla de la imagen de intensidad de dispersión estándar de OCT, y esta información adicional se puede utilizar para indicar cambios importantes en la muestra. Además, se puede extraer la "rigidez relativa" de una región como la longitud de onda cuadrática media, que será directamente proporcional al módulo de Young de un material isotrópico linealmente elástico, tal como se validó en muestras de agarosa. Mediante el uso de sistemas biológicos con propiedades de matriz variables, mostramos que este enfoque eficaz y 'fácil de usar' ofrece un gran avance en la evaluación mecánica de tejidos en línea de las propiedades mecánicas espaciales para organoides, tejidos blandos e ingeniería de tejidos.

El sistema utilizado para el estudio de gránulos de agarosa y hMSC fue un sistema OCT de dominio espectral Thorlabs Telesto-II con una longitud de onda de fuente central de 1310 nm equipado con una lente de exploración (LSM03 Thorlabs) que resultó en una resolución axial de 4,1 μm en tejido y una resolución lateral de 15 micrómetros. La adquisición consistió en 192 cuadros, cada uno con 1000 escaneos A a una velocidad de 48 kHz. En el caso de los geles de colágeno sembrados de ovocitos y cáncer, el sistema era un sistema Wasatch Photonics de 800 nm con un ancho de banda espectral de 92 nm, con mediciones que consistían en 100 cuadros de 512 A-scans a una velocidad de 30 kHz. En todos los casos, las muestras se colocaron en placas de pocillos de cultivo de tejido estándar en el mismo banco que la sonda OCT para permitir la transmisión de vibraciones.

El preprocesamiento se realizó con un software personalizado para: volver a muestrear el espectrómetro al espacio k, eliminar la señal de fondo y tomar la transformada rápida de Fourier para mapear en un espacio de retardo de valor complejo. Luego se estimaron los campos de desplazamiento entre fotogramas posteriores con

donde λ0 es la longitud de onda central de la fuente, neff es el índice de refracción efectivo de la muestra, ℜ y ℑ toman las partes real e imaginaria, y pt+1 es la medida compleja posterior de pt. A partir de estos campos de desplazamiento, las longitudes de onda elásticas se estiman a través de ().

Deseamos estimar la rigidez resuelta espacialmente de un material a través de su velocidad de onda dada como

donde ρ es su densidad de masa y M es algún factor de módulo elástico. Esta forma genérica se aplica a: ondas de corte, donde \(M=\frac{1}{3}\mu\), con μ el módulo de corte; Ondas P, donde \(M=K+\frac{4}{3}\mu\), con K el módulo volumétrico; y ondas superficiales de Rayleigh, donde \(M=\frac{{(0.862+1.14\nu )}^{2}}{2{(1+\nu )}^{2}}\mu\) con ν la de Poisson relación. Como con cualquier onda viajera, la velocidad se puede expresar como v = λf, donde λ es su longitud de onda espacial yf su frecuencia temporal. Si f y ρ se conocen o se sabe que son fijos a priori, entonces se puede calcular el módulo de elasticidad M directamente a partir de λ medido.

Suponiendo ondas de corte, como en las refs. 29,31, y un material isotrópico linealmente elástico, el módulo de Young se puede encontrar como

Dadas ondas elásticas periódicas que se propagan a través de un material heterogéneo, uno puede medir su desplazamiento en una posición x como

donde a es la amplitud de la onda, λ es la longitud de onda espacial y ϕ(t) es una función de fase que describe la posición de la onda en el tiempo t. También se puede estimar la tensión local como una aproximación de diferencias finitas a una derivada como

donde Δx es la resolución del sistema de imágenes. Dado que la energía de una sinusoide suficientemente muestreada es Nta2/2 independientemente del orden de las muestras, se deduce que λ se puede encontrar a través de

donde \(\mahop{\sum }\nolimits_{t = 1}^{{N}_{t}}d{(t)}^{2}\) es la energía de desplazamiento de una secuencia de mediciones de onda como se representa en la ecuación (4). La estimación en la ecuación. (6) es equivalente al presentado en la ref. 29 y utilizado en la ref. 30. La estimación en Eq. (6) es exacta en un sistema sin ruido cuando Δx → 0 y el número de muestras temporales Nt → ∞. En este caso, ϕ(t) puede tomar la forma ϕ(t) = kt, donde k es una función escalar o aleatoria que abarca [ − π, π] con una densidad de probabilidad uniforme. Por ejemplo, si uno tiene muestreo lineal con fluctuación de tiempo como ϕ(t) = kt + n con \(n \sim {{{{{{{\mathcal{N}}}}}}}}(0,{ \sigma }_{t}^{2})\), luego la Ec. (6) sigue siendo precisa para un número suficiente de mediciones.

Aunque la estimación de longitud de onda en Eq. (6) se cumple en el caso sin ruido, en la práctica está fuertemente sesgado por cualquier ruido de fase. Esto se debe a que la longitud de onda de corte está en el rango milimétrico29,31, que es mucho mayor que la resolución de muestreo espacial en OCT, por lo que cualquier ruido de banda ancha aditivo será amplificado por el gradiente en Eq. (5).

Para ruido gaussiano blanco aditivo (AWGN), \(n \sim {{{{{{{\mathcal{N}}}}}}}}(0,{\sigma }^{2})\), con varianza σ2, la energía de la señal después de filtrar con algún kernel h es

donde Nh es la longitud de h. Por ejemplo, la aproximación del gradiente de diferencia central en la ecuación. (5) es equivalente a filtrar espacialmente el vector de desplazamiento con kernel h = [ − 0.5, 0, 0.5]/Δx, que tiene una energía de En = 0.5σ2/Δx2. Si σ se puede estimar a partir de las muestras, entonces se puede formar la estimación sin sesgo de la longitud de onda como

donde * denota convolución espacial.

Mientras que la ecuación. (8) puede ser razonable en ruido moderadamente bajo, cuando las energías del ruido son similares a las energías de la señal, producirá una gran variación o incluso estimaciones indefinidas. Esto se puede compensar hasta cierto punto aumentando Ng o Nt, pero a expensas de la tasa de respuesta temporal y el tiempo de exploración o la resolución espacial en la dirección del gradiente y no controlará que el numerador se vuelva negativo. Por lo tanto, introducimos un filtro de paso bajo 2D adicional a los vectores de desplazamiento. Esta estimación filtrada sin sesgo como

donde g es el filtro de paso bajo 2D y Nh*g = Nh + Ng − 1 es la longitud del núcleo del filtro de deformación efectivo. Usamos una función gaussiana 2D para g, ya que no introducirá ningún artefacto ondulado, con tamaño Ng = ⌈2cg⌉ + 1, donde cg es su desviación espacial estándar de la gaussiana. El filtro gaussiano generó un patrón moteado en los mapas de contraste mecánico.

A pesar del filtrado y la reducción efectiva de la potencia del ruido en la Ec. (9), todavía puede haber casos de estimaciones indefinidas debido a la potencial negatividad. Para evitar esto, adoptamos un enfoque de 'resta suave' como se usa en la corrección de dispersión de tomografía computarizada de rayos X39

que reemplaza la operación a − b, donde γ es un factor de compensación que se puede calcular como

donde β = [0, 1] es un término de umbral que establecemos en β = 0.9 en este trabajo. En nuestros experimentos, esto solo comienza a contribuir muy profundamente en las muestras, donde la intensidad es demasiado baja para una medición confiable de todos modos.

Una última consideración para este método es determinar la varianza del ruido σ2. Bajo los supuestos, esto varía en el espacio y la longitud de onda es significativamente mayor que la resolución espacial del sistema OCT, se puede aproximar como la varianza promediada en el tiempo dentro de una ventana deslizante de 3 × 3.

En total, en este estudio se fabricaron hidrogeles de agarosa al 1%, 2% y 3% que contenían leche al 1%. Brevemente, se añadió agarosa tipo I (Fisher Scientific, Reino Unido) a agua destilada y se sometió a autoclave a 121 °C para obtener soluciones de agarosa al 2 %, 4 % y 6 %. Se preparó una solución de leche al 2 % disolviendo leche en polvo sin grasa (Bio-rad, Reino Unido) en agua destilada y esta solución se mezcló con un volumen igual de solución de agarosa al 2 %, 4 % y 6 % a 100 °C y se vertió en un plato. y se dejó solidificar a temperatura ambiente para producir geles de agarosa al 1%, 2% y 3% que contenían leche al 1%. Se prepararon geles híbridos al 2/3 % raspando parte del gel al 2 % y añadiendo solución de agarosa al 3 % en la placa y se dejó solidificar. A continuación, se extrajeron los núcleos de los geles utilizando un punzón de biopsia para producir discos de 6 mm de diámetro y 2 mm de espesor. Luego, estos geles se colocaron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con 100 μL de agua destilada que cubría la superficie de cada gel y se tomaron imágenes con OCT para medir la longitud de onda como se describió anteriormente.

El módulo de Young de estos geles de agarosa se analizó utilizando Bose ElectroForce 5500 (TA Instruments, Reino Unido). Brevemente, se eliminó el exceso de agua de los geles de agarosa y se utilizó una precarga de 0,01 N para asegurar el contacto directo entre la muestra y las superficies de la placa. Se realizó una rampa de compresión no confinada (hasta un 10 % de deformación del espesor de la muestra) y se calculó el módulo de Young a partir de la curva tensión-deformación.

La pata trasera de oveja se compró en un matadero local y se aislaron células madre mesenquimales (MSC) ovinas de la médula ósea del fémur. Por lo tanto, no se necesitó aprobación ética para este estudio. Las MSC del paso dos se tripsinizaron y se agregaron 200 000 células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V (Greiner bio-one) y se centrifugaron durante 5 min a 500 × g para formar sedimentos celulares.

Para la diferenciación condrogénica, los sedimentos celulares se cultivaron en un medio de diferenciación que consistía en DMEM con alto contenido de glucosa complementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, piruvato de sodio 100 μg/ml, L-glutamina 40 μg/ml. prolina, 50 μg/mL de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 4,7 μg/mL de ácido linoleico, 1,5 mg/mL de albúmina de suero bovino (BSA), 1 × insulina-transferrina-selenio, 100 nM dexametasona (todo de Sigma-Aldrich, Reino Unido) y 10 ng/mL de TGF-β3 humano recombinante (Peprotech, Reino Unido) durante 3 semanas, con intercambio de medio tres veces por semana. Durante este período de diferenciación, la mitad de los gránulos se sometieron a presión hidrostática (HP, 270 kPa, 1 Hz, 1 h/día) para mejorar la diferenciación, mientras que el resto no se estimuló y se mantuvo como control. Tanto los grupos de control como los de HP se recolectaron al final del período de diferenciación y se tomaron imágenes con OCT para medir la longitud de onda. A continuación, las muestras se digirieron con papaína para medir su contenido de glicosaminoglicanos (GAG) utilizando un ensayo de unión al colorante azul de dimetilmetileno. Las muestras también se recogieron para histología, se incluyeron en cera, se seccionaron y se tiñeron con azul alcián 8GX al 1 % en HCl 0,1 M para la distribución de GAG.

Para la diferenciación osteogénica, los sedimentos celulares se cultivaron en un medio de diferenciación que consistía en DMEM bajo en glucosa complementado con suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, dexametasona 100 nM, L-50 μM -ácido ascórbico-2-fosfato y β-glicerco-fosfato 10 mM (todos Sigma-Aldrich, Reino Unido) durante 3 semanas, intercambiando el medio tres veces por semana. Durante este período de diferenciación, las muestras se monitorearon continuamente usando OCT de manera estéril para medir la longitud de onda en los días 3, 10 y 21, y las muestras separadas en cultivo paralelo se terminaron para pruebas mecánicas e histología en los mismos puntos de tiempo. El módulo de Young de gránulos de células osteogénicas se probó utilizando un equipo personalizado diseñado para probar microesferas y organoides celulares40. Después de eliminar el exceso de agua, los sedimentos celulares se sembraron entre dos superficies de placa y se realizó una rampa de compresión no confinada (hasta un 25 % de deformación del diámetro de la muestra) y se calculó el módulo de Young a partir de la curva de tensión-deformación. Para el análisis histológico, los sedimentos celulares se incluyeron en cera, se seccionaron y se tiñeron con rojo picrosirius para la acumulación de colágeno.

Se crearon matrices de colágeno/fibroblastos utilizando la metodología descrita en Timpson et al.41. Las matrices se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 15 días para permitir que la matriz de colágeno/fibroblastos se contrajera. Se tomaron imágenes de la matriz de colágeno/fibroblastos mediante OCT los días 1, 4, 7, 11 y 15 de la contracción de la muestra.

Utilizando el protocolo descrito en Hallas-Potts et al.42, se prepararon una matriz de colágeno/fibroblastos con A2780 cultivada en la parte superior y una matriz de colágeno/fibroblastos en blanco sin células cultivadas en la parte superior y se transfirieron a una rejilla metálica. El traslado de la matriz de colágeno a la rejilla se refiere al día 0. Las placas se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 7 días para permitir que las células invadieran. Se tomaron imágenes de las matrices de colágeno/fibroblastos los días 2 y 7.

Inmediatamente después de la toma de imágenes de OCT, la matriz se retiró de la rejilla y se agregó a un tubo falcon con 5 ml de paraformaldehído (PFA) al 4 % (p/v) para fijarla durante la noche. La matriz fijada de colágeno/fibroblastos se incrustó en cera, se seccionó y se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) por el Laboratorio de Patología y Fenómica del Centro CRUK de Edimburgo. Se tomaron imágenes de las secciones teñidas en el modelo Nanozoomer XR, los datos se capturaron con NDP scan v 3.1. aumento de ×40.

Se compraron ojos de porcino recién enucleados al carnicero local. Para inducir la lesión corneal, se utilizó un sacabocados de biopsia de 5 mm para hacer un corte parcial en la córnea central a una profundidad de aproximadamente el 50 %. Luego, se llenó hasta el defecto una solución de fibroína de seda metacrilada (15 o 20% en peso) que contenía 0,5% (p/v) de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP) y se fotoentrecruzó durante 5 min (365 nm, 3mW/cm2). A continuación, se tomaron imágenes de la córnea fresca, la córnea lesionada y la córnea reparada con hidrogel de fibroína de seda con OCT para medir la longitud de onda como se describió anteriormente. El módulo de almacenamiento (G) de los hidrogeles Silk-MA recién preparados se midió en modo oscilatorio a 32 °C utilizando una geometría placa-placa (Kinexus Pro+, Malvern, Reino Unido). Después de ejecutar un barrido de amplitud para determinar el rango viscoelástico lineal (LVER), se realizó un barrido de frecuencia a una tensión de cizallamiento del 0,5 %. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Para demostrar el concepto de elastografía vibratoria, se ejecutó un conjunto de simulaciones FEM, como se resume en la Fig. 6. Esto se realizó con code_aster43 en una malla que contenía una placa de poliestireno de 24 pozos y gel heterogéneo con una carga dinámica aplicada axialmente a una esquina. del plato Había 36.000 nodos en el plano central del gel con un espesor de 2 mm y un diámetro de 10 mm, cuyas posiciones se muestrearon cada 10 μs durante un tiempo total de simulación de 5 ms. La señal de carga utilizada para la estimulación fue \(\sin (2\pi ft)/t\), donde f = 2 kHz, con la esquina opuesta fijada como condición límite; también se probaron otras combinaciones de cargas con campos de desplazamiento resultantes similares. y estimaciones.

a Muestra el gel asentado sobre la base en un pocillo. b Muestra las magnitudes de desplazamiento de la placa en t = 2 ms y t = 4 ms. c Muestra la fuerza de excitación aplicada a una esquina de la placa: una sinusoide de 2 kHz con amplitud decreciente exponencial. d Muestra ejemplos de los desplazamientos diferenciales en la dirección axial en el centro del gel. e Muestra la longitud de onda estimada sobre la superficie del gel y la realidad del terreno suponiendo ondas de corte de 2 kHz. Los gráficos de perfil del panel f son las líneas indicadas en e.

Las longitudes de onda de las ondas elásticas resultantes en este caso sin ruido se estimaron utilizando la ecuación. (6). En primer lugar, las posiciones axiales en cada instancia de tiempo se volvieron a muestrear en una cuadrícula polar con origen en el centro del gel para que las deformaciones se estimaran a lo largo de las secciones transversales efectivas que se usaron en la sección experimental. La estimación de la ecuación. (6) se aplicó a los campos de 400 desplazamientos (posición diferencial) entre t = [1, 4] ms. Finalmente, estas longitudes de onda se volvieron a muestrear en una cuadrícula cartesiana para formar una imagen.

Usamos una variante del método de borde Blonski44 también adoptada por la ref. 31 para la resolución espacial: primero ajustando la función sigmoidea

con el algoritmo de Levenberg-Marquardt para los parámetros (L, k, x0, C) y luego encontrar el ancho completo en la mitad del máximo (FWHM) de la derivada sigmoidea, que se puede expresar como

Utilizamos un ANOVA unidireccional seguido de una prueba de Tukey-Kramer en Matlab (The Mathworks) para probar diferencias significativas con valores de p <0,01 o <0,05 y un número de muestras N > 3.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos de tomografía de coherencia óptica generados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. El conjunto de datos de mediciones detrás de los gráficos de barras se puede encontrar en figshare. https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22148093.v3.

Los códigos de matlab para implementar los algoritmos descritos en este documento están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Nos gustaría agradecer el apoyo de un premio ERC Advanced a AJEH; 638836: H2020_ERC_DYNACEUTICS y MRC UKRMP Hub Engineering the Cell Environment.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jonathan H. Mason, Lu Luo.

Centro MRC de Medicina Regenerativa, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Jonathan H. Mason, Amelia Hallas-Potts, Vlastimil Srsen y Pierre O. Bagnaninchi

Instituto de Tecnología de la Salud, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Lu Luo & Alicia J. El Haj

Departamento de Ingeniería, Nottingham Trent University, Nottingham, Reino Unido

yvonne reinwald

Instituto Matemático, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Matteo tafetán y sarah aguas

Cancer Research UK Edinburgh Centre, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Amelia Hallas-Potts y C. Simon Herrington

Centro MRC para la Salud Reproductiva, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Chih-Jen Lin

Escuela de Ingeniería Química, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Inês A. Barroso, Zhihua Zhang, Zhibing Zhang y Anita K. Ghag

Instituto de Ciencia y Tecnología en Medicina, Universidad de Keele, Stoke-on-Trent, Reino Unido

Ying Yang

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JHM, LL, YR, YY, SW, AJEH y PB diseñaron el estudio, los experimentos y escribieron el artículo. JHM escribió el algoritmo. JHM y LL adquirieron exploraciones OCT. JHM, LL, YR, MF, AHP, VS, CJL, IAB, ZZ y AKG realizaron los experimentos. JHM, LL, CSH, AJEH y PB analizaron los datos.

Correspondencia a Alice J. El Haj o Pierre O. Bagnaninchi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Stefan Catheline y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Alexander Cartagena-Rivera, Anam Akhtar y Christina Karlsson Rosenthal.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Mason, JH, Luo, L., Reinwald, Y. et al. Elastografía de coherencia óptica de vibraciones ambientales desviadas para perfilar propiedades mecánicas de células, organoides y tejidos. Commun Biol 6, 543 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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Recibido: 13 Septiembre 2021

Aceptado: 31 de marzo de 2023

Publicado: 18 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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